细胞疗法

严重的异种移植物抗宿主病（xeno-GVHD）会缩短细胞治疗的评估窗口期
，
，
，，影响移植细胞疗法的疗效评估。。。。β2微球蛋白（β2 microglobulin，，B2M）是MHC I类分子的组成部分，
，
，
，广泛表达于有核细胞表面，，，参与机体的自身识别和抗微生物免疫反应。。。因此
，，，敲除MHC I类分子的β2微球蛋白（β2m）是一种有效降低GVHD发生风险的策略，，
，有助于延长细胞治疗的观察窗口并提高评估效率。
。。

(A) B2M参与MHC I类分子的组成；(B-C) B-NDG B2m KO plus小鼠（蓝线）在植入PBMCs后，，
，，相比于B-NDG小鼠（橙线）表现出更低的GVHD评分和更长的生存时间
；(D-E) 在B-NDG B2m KO plus小鼠中进行的CAR-T 体内药效研究，，，展示了肿瘤体积（D）和体重（E）。。
。。

• 将CD19-CAR T细胞或未转染T细胞与靶细胞（Daudi、、Raji
  、、
  、、K562）以5:1、、10:1和20:1的比例共培养24小时。。。使用可修饰活性染料通过流式细胞术评估肿瘤细胞毒性
  。
  。。。
• 结果显示，，与未转染T细胞相比，，，
  ，CD19-CAR T细胞对表达CD19的Daudi和Raji细胞表现出显著的细胞毒性
  。。。。然而，
  ，CD19-CAR T对不表达CD19的K562细胞没有特异性细胞毒性。。。。

• 将标记CFSE的CD19-CAR T与靶细胞（Raji
  、、、K562）以5:1、、
  、10:1和20:1的比例共培养72小时。。。。使用流式细胞术评估CD19-CAR T增殖。。。。
• 结果显示，
  ，CD19-CAR T细胞与表达CD19的Raji细胞共培养时表现出显著的增殖，
  ，，而与不表达CD19的K562细胞共培养时则无显著增殖。
  。

• 将CD19-CAR T与靶细胞（Raji
  、、K562）以5:1、、
  、10:1和20:1的比例共培养24小时。。
  。。通过流式细胞术评估CD19-CAR T的CD25和CD69的表达。。
• 结果显示，，，CD19-CAR T细胞与表达CD19的Raji细胞共培养时，，，CD25和CD69的表达显著增加，，，，而与不表达CD19的K562细胞共培养时则未见明显变化。。

• 将CD19-CAR T与靶细胞（Raji
  、、、
  、K562）以2:1、
  、5:1和10:1的比例共培养24小时。。。共培养后，
  ，，收集上清液，，，，并通过Bio-Lite Luciferase Assay系统检测IFN-γ和IL-2的分泌。。。
• 结果显示，，，，只有CD19-CAR T + Raji组的IFN-γ和IL-2分泌显著增加，，
  ，而CD19-CAR T + K562组或未转染组未见显著变化。。
  。

• 从CD19-CAR T或未转染T细胞中提取DNA，
  ，，分别在第10天和第13天收集。
  。标准和样品板每个孔含有两个重复孔
  。。。。绘制标准曲线浓度为10⁵拷贝/µL，，10⁴拷贝/µL，，10³拷贝/µL，
  ，，，10²拷贝/µL和10拷贝/µL。。

y轴表示Ct值，，，x轴表示标准拷贝浓度的对数（以10为底）。。标准曲线的斜率表示实时PCR扩增效率
。。当扩增效率为100%时，，，斜率为-3.32。。

• 扩增效率E=10^−1/斜率－1，，，实验的扩增效率为85%，，，我们正在尝试更特异的引物进行进一步实验
  。。。